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聚合酶鏈式反應ELISA法

聚合酶鏈式反應（PCR）是分子生物學技術(shù)中檢測DNAzui靈敏的方法之一，而酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是免疫學中zui敏感和特異的檢測方法的代表。聚合酶鏈式反應ELISA法（PCR-ELISA）集上述兩方法之精髓，成為繼PCR之后又一個靈敏性更高、特異性更強、省時易行的新方法[7]。根據(jù)生物素和地谷新標記底物的不同，PCR-ELISA主要分為兩大類：*類為用生物素和地谷新同時對PCR產(chǎn)物進行標記；第二類則是分別對PCR擴增產(chǎn)物和核酸雜交探針進行標記。

生物素和地谷新同時標記PCR產(chǎn)物主要有三種途徑：①在PCR反應混合物中同時加入生物素和地谷新標記的脫氧核苷酸類似物（DIG-Bio-dUTP）;②加入生物素化的引物和DIG-dUTP;③加入生物素化引物1和地谷新標記的引物2。實驗方法如下：將標記的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀，或用純化柱除去未結(jié)合的標記物，加至親合素包被的酶標板孔中孵育1~2h，*洗滌，加抗地谷新抗體，然后加入堿性磷酸酶結(jié)合物底物孵育，終止反應后，根據(jù)吸光度（A）值判斷結(jié)果。這類親合素介導的固相捕獲生物素標記的靶分子檢測系統(tǒng)，靈敏度高于PCR檢測，且操作簡便、快速，重復應用性好，可以在短時間內(nèi)（<4h）準確檢測大量的臨床標本（血清、分泌液或甲醛固定標本）；通過適當調(diào)整PCR循環(huán)次數(shù)及相關參數(shù)并對多時間點上產(chǎn)量進行線性分析，可對PCR產(chǎn)物進行定量分析。由于檢測系統(tǒng)是建立在雙標記核酸片段上的，有時會出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物吸附，引起本底偏高的現(xiàn)象。

第二類PCR-ELISA為生物素和地谷新分別標記PCR擴增產(chǎn)物和核苷酸探針。用生物素化的引物進行PCR擴增，然后加入親和素包被的酶標板中，冰浴1h，經(jīng)洗滌后加入變性劑（50mmol/L NaOH）室溫作用數(shù)分鐘，加入雜交液和地谷新標記的探針，雜交完成經(jīng)洗滌后加入堿性磷酸酶標記的抗地谷新抗體，室溫下作用1h經(jīng)充分洗滌后加顯色劑，讀取A值。該方法利用生物素化引物獲得含生物素的PCR產(chǎn)物，使產(chǎn)物能與包被在酶標板上的親和素牢固地結(jié)合，使特異性PCR擴增產(chǎn)物吸附于酶標板上，繼而用地谷新標記的探針進行雜交和放大，這一方法特異性強，靈敏度高，重復性好。

PCR-ELISA方法的*性主要表現(xiàn)在以下四個方面。①利用生物素-親和素系統(tǒng)的強大親和能力，其親和常數(shù)K約為抗原抗體的104~107倍，為A蛋白（SPA）對IgF。的108倍。生物素和親和素二者高度特異的快速結(jié)合，不易受外界干擾，復合物十分穩(wěn)定，極少發(fā)生離解，提高了實驗的穩(wěn)定性，縮短了反應時間。此外，親和素不含糖基，等電點為pH=6.0，與其他抗原或抗體包被酶標板比較，其非特異性吸附顯著減少，靈敏度得到提高。②PCR擴增使陽性信號通過擴增本身以及地谷新抗原抗體反應得到極大程度的放大，從而使檢測的靈敏度進一步提高。③PCR-ELISA中尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)移酶的使用，使PCR技術(shù)中交叉污染得以極大程度的控制而不影響檢測效果，基本克服了PCR雜交技術(shù)中由于污染造成的假陽性問題。④標記探針的使用，使檢測的特異性進一步提高，可以與放射性標記的Southern雜交相媲美，且探針的引進使其應用的范圍增大，比PCR本身在基因多態(tài)性分析、病毒分型、克隆鑒定等方面顯示了其*的優(yōu)勢。另外，非同位素標記系統(tǒng)的應用又避免了使用同位素帶來的危害，而且整個實驗周期較Southern雜交明顯縮短（約 6h），并且操作簡便，可用于大批量標本的同時檢測。當然PCR-ELISA方法的建立有一定的要求，其中PCR產(chǎn)物和探針的雜交條件（PCR產(chǎn)物的稀釋度、雜交溫度和時間）與檢測敏感性、特異性有密切關系。