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                   卡那霉素快速檢測試劑盒

使用說明書

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被卡那霉素偶聯抗原，樣本中的殘留物卡那霉素和微孔條上預包被的卡那霉素偶聯抗原競爭卡那霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物卡那霉素的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物卡那霉素的含量。

【試劑盒技術指標】   

規       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間：45min

樣本定量檢測下限

組織(豬肉/肝 雞肉/肝 /水產）………………………2ppb

蜂蜜 ………………………………………………… 2ppb

牛奶 ………………………………………………… 2ppb

交叉反應率

卡那霉素……………………………………………100%

卡那霉素……………………………………………  <0.1%

雙氫卡那霉素………………………………………… <0.1%

樣本回收率

組  織……………………………………………85±10%

蜂蜜 ……………………………………………85±10%

牛奶 …………………………………………  85±10%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標記物       7ml………………………紅色帽

5、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

8、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

10、 2X 濃縮復溶液  50ml ·……………… 藍色帽

【所用儀器、試劑】   

儀器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O、NaCl

【實驗前溶液配制】

配液1、0.02M PBS緩沖液         5.16gNa2HPO4*12H2O+0.87gNaH2PO4*2H2O

        +8.5gNaCl，加入蒸餾水至1000ml）用于樣品提取液的配制。

配液2、 1X復溶液

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份2X濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本提取后的復溶)。

配液3、1X洗滌液

將20X濃縮洗滌液用去離子水按 1：19稀釋（1份20X濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

(a)組織(豬肉/肝 雞肉/肝 /水產）/蜂蜜樣本前處理方法

1、 取2±0.05g樣本與4ml 0.02MPBS緩沖液混合5min，置56℃水浴環境放置15min；

2、 3000g以上，室溫離心5min；

3、 取50µl上清液，加入450µl  的1X復溶液混勻，混合30s；

4、 取50µl用于分析。

5、 樣本稀釋倍數：20

（b）牛奶

1、取1ml牛奶樣本于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，去除上層脂肪。

2、取50µl上清液，加入950µl  的1X復溶液混勻，混合30s

3、取50µl液體用于分析。

          樣本稀釋倍數：20倍 

【酶標免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，每孔加酶50µl，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。

5、 取出酶標板，將孔內液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

1、粗略判定：

      用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中卡那霉素實際濃度。        

2、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以卡那霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中卡那霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

卡那霉素(ppb) [µg/kg]

圖1：卡那霉素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV 

            0       0.1    0.3   0.9   2.7    8.1

      圖2：卡那霉素檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出卡那霉素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應卡那霉素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。

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